Этапность формирования нарушений клеточного иммунитета при инфекционном синдроме у детей

Е.В. АГАФОНОВА *, Т.А. ВЕЛИЖИНСКАЯ **, К.В. СИТКИНА *

*КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

** РЕСПУБЛИКАНСКАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ БОЛЬНИЦА № 2 МЗ РТ

STAGE FORMING THE BREACHES CELLUAR IMMUNITY UNDER INFECTIOUS SYNDROME AT CHILDREN
E.V. AGAFONOVA, T.A. VELIZHINSKAYA, K.V. SITKINA

Under chronic somatic disease at children (the nosology variants are presented sick with leading clinical symptomatic of the diseases upper division gastrointestinal tract, associated with infection Helicobacter pylori and mushroom the sort of Candida – chronic gastroduodenitis (HGD) and peptic ulcer (YAB) (N=89), as well as with chronic pyelonephritis (HPN), associated with bacterial and fungous uropathogeni (N=66)) was conducted study immune status by method flowing cytofluorometrii with use double and three-colored staining MKAT («Becton Dickinson», U.S.A.) on flowing cytometris «FACSCalibur». For estimation stage shaping secondary immunological to insufficiency under infectious syndrome ball system sign was designed at children adding literature data and long own experience of the authors and valuing clinical markers, given objective checkup and stale laboratory methods of the study. The Chosenned stages ( the laboratory types) secondary immunological to insufficiency under infectious syndrome at children in system clinical markers — a laboratory factors immune status reflecting speaker of the quantitative contents immunocompetent cells and their functional activity.

Несмотря на успехи, достигнутые в лечении и профилактике хронических соматических заболеваний у детей, вызванных бактериальной, вирусной и грибковой флорой, возрастает число тяжелых форм, а также форм с торпидным течением воспалительного процесса, частными рецидивами и малой эффективностью от адекватной этиотропной терапии [1, 2]. Длительное персистирование патогенов определяет формирование нарушений иммунологической реактивности и развитие вторичной иммунологической недостаточности (ВИН) [3]. Основным клиническим маркером ВИН является инфекционный синдром, клинически проявляющийся хроническими заболеваниями инфекционной природы, резистентными к традиционной терапии [1–5]. Несмотря на наличие общепринятых маркеров иммунологической недостаточности при исследовании иммунного статуса, современная методология оценки иммунитета позволяет проводить поиск новых лабораторных критериев ВИН и оценки тяжести инфекционного синдрома [5, 6].

Все более широкое применение в оценке иммунного статуса находит метод проточной цитофлюориметрии с использованием двойных и тройных меченых моноклональных антител (МКАТ), позволяющий оценивать различные субпопуляции и популяции иммунокомпетентных клеток через исследование экспрессии маркеров активации, оценивать функциональную активность клеток, апоптоз различных клеточных популяций [5, 6]. При хронических соматических заболеваниях взаимосвязи между иммунитетом и инфекцией довольно сложные: инфекция может быть как причиной ВИН, так и ее следствием. Изучение причинно-следственных взаимоотношений в системе «клинические маркеры ВИН-иммунные показатели» является весьма актуальной задачей [1, 5]. Многообразие лабораторных проявлений инфекционного синдрома при исследовании иммунного статуса предполагает наличие определенных закономерностей (этапов) формирования иммунологической недостаточности.

У детей в условиях онтогенеза иммунной системы и незрелости основных звеньев иммунитета клинические маркеры инфекционного синдрома весьма разнообразны [5]. Поиск новых лабораторных маркеров ВИН, оценка взаимосвязей между лабораторными показателями и клиническими маркерами инфекционного синдрома, изучение закономерностей формирования нарушений иммунитета являются важными задачами клинической иммунологии.

Цель исследования. При инфекционном синдроме у детей, ассоциированном с хроническими соматическими заболеваниями, провести углубленное исследование иммунного статуса методом проточной цитофлюориметрии для выявления закономерностей формирования иммунологической недостаточности.

Материалы и методы. Обследованы 155 детей с длительным течением инфекционного синдрома в возрасте от 7 до 15 лет с хроническими соматическими заболеваниями (нозологические варианты представлены больными с ведущей клинической симптоматикой заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с инфекцией Неlicobacter pylori и грибами рода кандида: хроническими гастродуоденитами (ХГД) и язвенной болезнью (ЯБ) (N=89), а также с хроническими пиелонефритами (ХПH), ассоциированными с бактериальными и грибковыми уропатогенами (N=66).

Анализ данных литературы [1–5, 7–9], а также сопоставление клинических маркеров и данных комплексной оценки иммунного статуса позволило выработать балльную систему признаков, оценивающую тяжесть иммунологической недостаточности (таблица). Учитывали длительность заболевания, тяжесть инфекционного синдрома по основному заболеванию, наличие политопного инфекционного синдрома, ассоциированного с заболеваниями ЛОР- органов, кожи, частыми ОРВИ, рецидивирующими бактериальными инфекциями дыхательных путей, мочевыводящей системы. Особое значение придавали наличию кандидозной инфекции как маркеру иммунологической недостаточности, преимущественно Т-клеточного типа [4, 10]. Проводили посевы мочи на грибы рода кандида, микологическое культуральное исследование биоптатов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (Казанский НИИЭМ, лаборатория микологии). Формирование инвазивного кандидоза подтверждали определением уровня циркулирующего маннаново-полисахаридного антигена грибов Candida albicans (метод иммуносенсоров, Казанский НИИЭМ). Использовали оригинальный иммуносенсорный метод обнаружения маннанового антигена в сыворотке крови (Халдеева Е.В., Глушко Н.И. 1992). Учитывали также данные анамнеза – наследственность, антенатальный период, патологию периода новорожденности, перенесенные заболевания и сопутствующие иммунопатологические синдромы, данные объективного осмотра и рутинных лабораторных исследований. Дети, набравшие 5–15 баллов, составили группу 1, 15–25 баллов – группу 2, более 25 баллов – группу 3. В контрольную группу вошли здоровые дети, cопоставимые по полу и возрасту.

Иммунофенотипирование проводили с использованием МКАТ “Becton Dickinson“ (CША) на проточном цитофлюориметре “FACSCalibur”, оснащенном двумя лазерами, с применением двух- и трехпараметрического анализа. Для максимально корректного определения популяции и субпопуляции иммунокомпетентных клеток, исследования экспрессии маркеров активации и апоптоза [СD3+СD19-Т-лимфоциты, CD3+CD4+-Т-хелперы, СD3+CD8+-Т-цитотоксические, CD3-CD19+-В-лимфоциты, CD5+CD19+-В1 (минорная популяция В-лимфоцитов), CD16/56+CD3- NК-клетки, без учета Т-лимфоцитов с экспрессией СD16, CD3+CD16/56-NКТ-клетки, CD3-CD4-CD8-, CD4+CD8+- незрелые Т-лимфоциты (минорные популяции), СD3+HLADR+, CD8+HLADR- активированные Т-лимфоциты, СD3-HLADR+ активированные В-лимфоциты и NK, СD4+CD25+Hi-Т регуляторные лимфоциты (Трег), CD4+62L+, CD4+62L- эффекторные популяции Т-хелперов] использовали реагенты “MultiTest”, “Simulset”, “IMK Plus Kit”. Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. Дефицит абсолютного количества CD3+СD19- проградиентного нарастал в группах 1 (p<0,05), 2 (p<0,05) и 3 (p<0,001) (рис. 1). Относительное снижение CD3+CD19- имело место в группах 2 (p<0,05) и 3 (p<0,001). Абсолютное снижение СD3+CD4+ выявлено в группе 1 (p<0,05). Относительное и абсолютное снижение Т-хелперов отмечено в группах 2 (p<0,05) и 3 (p<0,05) . Низкая экспрессия СD3 – общего популяционного маркера Т-лимфоцитов, является отражением дефекта Т-клеточного звена иммунитета [11], по мнению

 

других авторов – отражением мобилизации иммунной системы с преобладанием молодых незрелых форм Т-лимфоцитов, еще не экспрессирующих CD3, но экспрессирующих комплексы антигенов для МНС 1 класса (major histocompatibility complex) (CD8+) или антигенов МНС II (CD 4+) [12]. В пользу первого мнения свидетельствует одновременное снижение СD4+ лимфоцитов. Cодержание СD3+CD8+ повышалось в группе 1 (p<0,05), в группах 2 и 3 отмечено снижение относительного содержания CD3+CD8+ по сравнению с контрольной (p<0,05, p<0,001соответственно). В группах 2 и 3 увеличивалось содержание незрелых клеток – CD4+CD8+ (дубльпозитивных), CD3-СD4-CD8- (дубльнегативных). В литературе имеются сообщения о выбросе из тимуса ранних клеток с фенотипом кортикальных тимоцитов при иммунодефицитных состояниях [12], по данным [13] функционально данная популяция клеток недостаточна активна. Некоторые авторы также обращают внимание на активацию процессов апоптоза в CD4+CD8+ лимфоцитах [14]. На фоне достоверного снижения популяции CD16/56+CD3- в группах 2 и 3 (p<0,05, p<0,001), нарастало содержание NKT- (CD16/56+CD3+) (p<0,05, p<0,001) и NК-подобных лимфоцитов (CD8+3-) (p<0,05, p<0,001). Большинство исследователей считают популяцию NKТ ответственной за реализацию цитокинового взрыва [15], в том числе, включающего повышенную выработку интерлейкинов Тh2-профиля в ответ на антигенную стимуляцию. Другие исследователи [16] относят NKT-лимфоциты к популяции Т-регуляторных клеток, приобретающих супрессорные характеристики в процессе антигенной стимуляции. В литературе также обсуждается вопрос о функциональных свойствах субпопуляции CD3-CD8+ [6], им приписываются функции Th3-лимфоцитов, Т-супрессоров, NК-подобную активность. Не исключают также, что эти примитивные (по репертуару Т-клеточного рецептора) клетки способны изменять свой фенотип при изменении цитокинового фона. В группах 2 и 3 нарастало также и количественное содержание популяций В-лимфоцитов – В2 (СD19+CD3- – классические В-лимфоциты) и В1(CD5+CD19+- – минорная популяция, преимущественно полиреактивный продуцент IgM) (p<0,05, p<0,001 соответственно). Популяция В1 [17] составляет основную часть В-клеточного репертуара новорожденных и является одной из причин физиологического транзиторного дефицита данного периода.

 

 

Ее повышение свидетельствует о формировании иммунологической несостоятельности по гуморальному типу. Анализ экспрессии маркеров активации в лимфоцитарном гейте (рис. 2) выявил повышенную экспрессию HLADR-антигенов на популяции Т-лимфоцитов в группе 1 (p<0,05), в группах 2 и 3 имело место снижение СD3+HLADR+ (p<0,05, p<0,001 соответственно) и нарастание CD3-HLADR+ преимущественно за счет CD19+HLADR- (p<0,05, p<0,001 соответственно). Молекулам HLADR отводится ключевая роль в регуляции всех типов антигенпредставляющих клеток, они ассоциируются с Т-клеточной активацией и выполняют функцию презентации антигенов CD4+ клеткам [7, 18].

 

Снижение экспрессии HLADR-антигенов сопровождает большинство иммунодефицитных состояний, а также выявляется при хронических инфекциях [6, 19]. Имело место достоверное повышение маркеров Fas-зависимого апоптоза на популяции CD3+, что коррелирует с нарастанием в циркуляции дубльпозитивных Т-клеток [6, 12]. Выявлено повышение экспрессии CD95 на субпопуляции Т-лимфоцитов, что характеризует повышенную готовность клеток к апоптозу, содержание популяции СD3+CD95+ нарастало в группах 2 (p<0,05) и 3 (p<0,001). Содержание CD62L+4+ (популяция Т-хелперов, экспрессирующая рецепторы хомминга – неактивированные Т-хелперы, по некоторым данным, популяция “наивных” лимфоцитов) повышалась в группе 3 (p<0,05). К субпопуляциям, вызывающим активный интерес исследователей в последние годы, относится CD4+62L-. Эти клетки относят к высокодифференцированным эффекторам, мигрирующим в очаги воспаления и характеризующимся высокой способностью к продукции IGN-g, что ассоциируется с Th1- девиацией иммунного ответа [20]. Проградиентное снижение субпопуляции CD4+62L- имело место группах 2 и 3 (p<0,05, p<0,001 соответственно). Динамика CD4+25+Hi (Т рег.) имела противоположную направленность, так как отмечено достоверное нарастание данной популяции в группах 2 и 3 (p<0,05, p<0,001 соответственно). Интенсивное изучение данной популяции Т-лимфоцитов, которое ведется последние 10 лет [11], показало, что эти клетки формируются в процессе нормальной дифференцировки в тимусе и обладают выраженной регуляторной (супрессорной) активностью.

С нарастанием клинических маркеров иммунологической недостаточности (ИН), по нашим данным, ассоциируется проградиентное снижение популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток СD3+CD19-, CD3+CD4+, CD3+CD8+, появление в циркуляции незрелых популяций Т-лимфоцитов, повышенная экспрессия маркеров Fas-зависимого апоптоза, нарастание количества Трег клеток при пониженном содержании эффекторных Т-лимфоцитов.

Нарушения, идентифицированные в рамках ИН, имеют определенные этапы формирования. ИН1 (1-й тип) – снижение содержания Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперов по абсолютным показателям, появление в циркуляции NK-подобных лимфоцитов, при компенсаторном повышении цитотоксических Т-, NK-, NKT-лимфоцитов. ИН2 (2-й тип) – снижение содержания CD3+ (по относительным и абсолютным показателям на фоне лейкопении и/или лимфопении) и/или СD 4+ (по относительным и абсолютным показателям на фоне лейко- и/или лимфопении), наличие функционально-малоактивных клеток – незрелых популяций Т-лимфоцитов при снижении количества цитотоксических Т-лимфоцитов. На фоне данных нарушений сохраняется компенсаторное повышение количества NK- и NKT-клеток. Иммунорегуляторный индекс – ИРИ (СD3+СD4+/CD3+CD8+) при сниженных показателях превышает 1, понижено содержание эффекторных Т-лимфоцитов. ИН3 (3-й тип) – снижение содержания CD3+СD19, СD3+СD4+, СD3+DR+, CD3+CD8+, CD16+CD3- на фоне повышения NKT, ИРИ<1, наличие СD4+CD8+ и СD3-CD4-CD8-, повышение содержания Трег на фоне снижения популяции Т-эффекторов. При анализе типов ИН 1-й тип отмечен у 25%, 2-й – у 50%, 3-й тип имел место у 25% обследованных детей.

ВЫВОДЫ

1.Метод проточной цитофлюориметрии с использованием двухцветного и трехцветного окрашивания МКАТ позволяет значительно расширить возможности диагностики нарушений иммунологической реактивности при инфекционном синдроме у детей

2. При проградиентном нарастании клинических маркеров иммунологической недостаточности имеет место определенная динамика количественного содержания иммунокомпетентных клеток и их функциональной активности

3. Выделение лабораторных типов нарушений иммунологической реактивности в рамках инфекционного синдрома позволит более дифференцированно подходить к иммунокоррекции при хронических соматических заболеваниях у детей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Малашенкова И.К. // Cell Therapy_ru // “Медицинская библиотека” Иммунология Принципы иммунокорригирующей терапии вторичных иммунодефицитных состояний, ассоциированных с хронической вирусно-бактериальной инфекцией. C. 8.

 

2. Ильина Н.И., Латышева Т.В., Пинегин Б.В., Сетдикова Н.Х. Синдром вторичной иммунологической недостаточности (Протоколы диагностики и лечения) // Иммунология. – 2000. – № 5. – С. 8–9.

 

3. Нестерова И.В. Алгоритмы обследования пациентов со вторичными иммунодефицитными состояниями, сопровождающимися ведущим синдромом вирусно-бактериальной инфекции // Inter. J. on Immunorehabilitation. – 2000. – № 1. – C. 72–86.

 

4. Aлешина Р.М. Cиндром вторичной иммунологической недостаточности: клинико-лабораторная характеристa // Интернет. Клинич. иммунология. Аллергология. Инфектология. – C. 6.

 

5. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии // Иммунология. – 2001. –№ 4. – C. 4–6.

 

6. Порядин Г.В., Салмаси Ж.В., Казимирский А.Н. Активационные маркеры лимфоцитов как показатели дизрегуляции иммунной системы при воспалении // Патологич. физиология и эксперимент. терапия. – 2006. – № 1. – С. 2–7.

 

7. Галактионов В.Г. Иммунология. – М., 1998. – 354 с.

 

8. Ярцев М.Н., Яковлев К.П., Плахтиенко М.В. Иммунная недостаточность и часто болеющие дети // Рос. аллергологич. журнал. – 2008. – № 1. – C. 199–203.

 

9. Ширинский В.С., Cтаростина Н.М., Cенникова Ю.А., Малышева О.А. Проблемы диагностики и классификации вторичных иммунодефицитов // Аллергология и иммунология. – 2000. – Т. 1. – C. 62–70.

 

10. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. – М.: Триада-Х, 2000. – 472 с.

 

11. Яриллин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор Foxp 3 // Иммунология. – 2006. – № 3. – С. 176–184.

 

12. Баева Е.В., Соколенко В.Л., Базыка Д.А. Модификация экспрессии Т-клеточных активационных маркеров лимфоцитами периферической крови лиц, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях // Иммунология. – 1999. – №1. – C. 54–58.

 

13. Swat W., Desting M., Baron A. et all // Phenotypic changes accompanying positive selections of CD4+CD8+ thimocytes // Eur. J. Immunol. – 2002. – Vol. 22. – P. 2367–2372.

 

14. Mac Closkey T.V., Oyaizi N., Caronezi M., Pahwa S. // Use of flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes // Clin. Immunol. Immunopathol. – 2004. – Vol. 71. –P. 14–18.

 

15. Cепиашвили Р.И., Балмасова И.П. Естественные киллеры и их рецепторы, специфичные к МНС1 // Иммунология. – 2006. – № 1. – C. 46–51.

 

16. Манских В.Н. Натуральные киллеры – отдельный класс иммунокомпетентных клеток или совокупность функциональных субпопуляций // Иммунология. – 2006. – № 1. – C. 56–57.

 

17. Евстропова В.В. В1-лимфоциты: физиология, функции, популяционная гетерогенность // Иммунология. – 2006. – № 6. – С. 46–55.

 

18. Мазуров Д.В., Мастернак Ю.А., Пинегин Б.В. Возрастные изменения Т-лимфоцитов человека, несущих маркеры СD45RO и HLADR // Иммунология. – 2002. – № 5. – C. 268–271.

 

19. Титов Л.П., Кирильчик Е.Ю. Особенности иммунного статуса у часто и длительно болеющих детей с сопутствующей аллергической патологией // Иммунология. – 2000. – № 3. – C. 31–33.

 

20. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета // Иммунология. – 2002. – № 2. – C. 77–79.

Обсуждение закрыто.

Яндекс.Метрика